Bakgrunnsteori
Restriksjonsenzymer er enzymer som fungerer som molekylære «sakser» og kan klippe ut deler av DNA ved at de gjenkjenner helt spesifikke basesekvenser. Dette er et nyttig verktøy hvis du ønsker å sette sammen DNA fra ulike organismer. For at de ulike DNA-bitene skal feste seg til hverandre, bruker man enzymet ligase. Det danner bindinger mellom de ulike basene og «limer» dermed bitene sammen.
Til å kunne overføre biter av DNA fra en organisme til en annen bruker man ofte plasmider. Plasmider er sirkulære DNA-molekyler som er isolert fra bakterier og inneholder bare noen få gener. Hvis man setter inn ønskede DNA-biter i et plasmid i en bakterie, vil disse DNA-bitene bli kopiert hver gang bakterien formerer seg.
Til å sjekke om genredigeringen er vellykket, bruker man seleksjonsmarkører. En seleksjonsmarkør kan for eksempel være et gen som gir bakterien antibiotikaresistens, eller et gen som gir bakterien fluorescens. På den måten kan du velge ut og dyrke fram bare de bakteriene som viser vellykket genredigering.
Utstyr og forberedelse – lærer
- saks merket «restriksjonsenzym»
- lim eller teiprull merket «enzymet ligase»
- fargestifter
- utskrevne papirmaler (se vedlagt PDF nederst på siden)
Maler til merking av saks og lim eller teiprull ligger i den vedlagte PDF-filen sammen med papirmaler for isolert DNA fra spyttprøve og plasmid. Det kan være en fordel at DNA-sekvensen som illustrerer plasmidet, allerede er klippet ut og formet som en ring.
Oppdrag
Du skal overføre et humant gen til en bakterie, som igjen skal masseprodusere det proteinet det humane genet koder for.
Framgangsmåte
Nå skal du få øve på kutting og liming av DNA. Vi bruker papirstrimler som modell for DNA, saks som restriksjonsenzym og lim eller teip som enzymet ligase.
Verktøy i arbeid med DNA
- humant DNA fra spyttprøve (lineært DNA)
- gen som koder for ønsket egenskap (lineært DNA)
- plasmid (sirkulært DNA)
- restriksjonsenzymer
- enzymet ligase
- seleksjonsmarkør
For å kunne jobbe med genteknologi trenger du isolert DNA. Dette har du fått utdelt på et eget ark. Det første du må gjøre, er å identifisere genet som koder for en ønsket egenskap, i den isolerte DNA-prøven. Baserekkefølgen til genet er angitt i tekstboksen under. Bruk fargestifter til å markere genet i DNA-prøven. Obs! Det er bare baserekkefølgen til den ene tråden av genet som er oppgitt.
Gen som koder for ønsket egenskap:
AATTCCGACGTTACGTTAATGCTAGAGGCTGCG
- Når du har identifisert genet som koder for den ønskede egenskapen, må du velge et restriksjonsenzym som kan brukes til å klippe DNA-tråden. Velg restriksjonsenzymet som passer til å klippe ut genet ditt, fra figuren under. Åpne bilde i et nytt vindu
- Marker alle restriksjonssetene for det valgte restriksjonsenzymet med en ny fargestift. Obs! Det er viktig at restriksjonsenzymet du har valgt, ikke kutter i genet du ønsker å jobbe videre med.
- For at genet som koder for ønsket egenskap, skal kunne settes inn i bakteriens plasmid, må plasmidet kuttes med samme restriksjonsenzym som du valgte for å klippe ut genet, slik at endene passer sammen. Marker alle restriksjonssetene for det valgte restriksjonsenzymet i plasmidet med en fargestift.
- Nå er det på tide å la restriksjonsenzymene gjøre jobben sin. Husk at restriksjonsenzymene klipper i bestemte mønstre.
- Overfør genet som koder for ønsket egenskap, til plasmidet. Passer bitene sammen? Bruk enzymet ligase til å lime bitene sammen.
- Genet som koder for ønsket egenskap, inneholder en seleksjonsmarkør. Sjekk om genmodifiseringen ble vellykket, ved å identifisere seleksjonsmarkøren i genet du har satt inn i plasmidet. Bruk gjerne en fargestift til å markere seleksjonsmarkøren.
Seleksjonsmarkør:
TGCAATT
- Gratulerer med vellykket framstilling av rekombinant DNA og bruk av illustrert genteknologi. For at proteinet det humane genet koder for, skal kunne masseproduseres, må plasmidet settes inn i en bakterie som dyrkes videre under optimale forhold. Bruk kreativiteten din for å illustrere dette.
Filer
Denne siden er en bearbeidet utgave av Modellforsøk – rekombinant DNA fra Bioteknologirådet.