Bakgrunnsteori
Restriksjonsenzym er enzym som fungerer som molekylære «sakser» og kan klippe ut delar av DNA ved at dei kjenner igjen heilt spesifikke basesekvensar. Dette er eit nyttig verktøy viss du ønskjer å setje saman DNA frå ulike organismar. For at dei ulike DNA-bitane skal feste seg til kvarandre, bruker ein enzymet ligase. Det dannar bindingar mellom dei ulike basane og «limer» dermed bitane saman.
Til å kunne overføre bitar av DNA frå ein organisme til ein annan bruker ein ofte plasmid. Plasmid er sirkulære DNA-molekyl som er isolerte frå bakteriar og inneheld berre nokre få gen. Viss ein set inn ønskte DNA-bitar i eit plasmid i ein bakterie, vil desse DNA-bitane bli kopierte kvar gong bakterien formeirar seg.
Til å sjekke om genredigeringa er vellykka, bruker ein seleksjonsmarkørar. Ein seleksjonsmarkør kan til dømes vere eit gen som gir bakterien antibiotikaresistens, eller eit gen som gir bakterien fluorescens. På den måten kan du velje ut og dyrke fram berre dei bakteriane som viser vellykka genredigering.
Utstyr og førebuing – lærar
- saks merkt «restriksjonsenzym»
- lim eller teiprull merkt «enzymet ligase»
- fargestiftar
- utskrivne papirmalar (sjå vedlagd PDF nedst på sida)
Malar til merking av saks og lim eller teiprull ligg i den vedlagde PDF-fila saman med papirmalar for isolert DNA frå spyttprøve og plasmid. Det kan vere ein fordel at DNA-sekvensen som illustrerer plasmidet, allereie er klipt ut og forma som ein ring.
Oppdrag
Du skal overføre eit humant gen til ein bakterie, som igjen skal masseprodusere det proteinet det humane genet kodar for.
Framgangsmåte
No skal du få øve på kutting og liming av DNA. Vi bruker papirstrimlar som modell for DNA, saks som restriksjonsenzym og lim eller teip som enzymet ligase.
Verktøy i arbeid med DNA
- humant DNA frå spyttprøve (lineært DNA)
- gen som kodar for ønskt eigenskap (lineært DNA)
- plasmid (sirkulært DNA)
- restriksjonsenzym
- enzymet ligase
- seleksjonsmarkør
- For å kunne jobbe med genteknologi treng du isolert DNA. Dette har du fått utdelt på eit eige ark. Det første du må gjere, er å identifisere genet som kodar for ein ønskt eigenskap, i den isolerte DNA-prøva. Baserekkjefølgja til genet er angitt i tekstboksen under. Bruk fargestiftar til å markere genet i DNA-prøva. Obs! Det er berre baserekkjefølgja til den eine tråden av genet som er oppgitt.
Gen som kodar for ønskt eigenskap:
AATTCCGACGTTACGTTAATGCTAGAGGCTGCG
Når du har identifisert genet som kodar for den ønskte eigenskapen, må du velje eit restriksjonsenzym som kan brukast til å klippe DNA-tråden. Vel restriksjonsenzymet som passar til å klippe ut genet ditt, frå figuren under.
Opne bilete i eit nytt vindauge
- Marker alle restriksjonsseta for det valde restriksjonsenzymet med ein ny fargestift. Obs! Det er viktig at restriksjonsenzymet du har valt, ikkje kuttar i genet du ønskjer å jobbe vidare med.
- For at genet som kodar for ønskt eigenskap, skal kunne setjast inn i plasmidet frå bakterien, må plasmidet kuttast med same restriksjonsenzym som du valde for å klippe ut genet, slik at endane passar saman. Marker alle restriksjonsseta for det valde restriksjonsenzymet i plasmidet med ein fargestift.
- No er det på tide å late restriksjonsenzyma gjere jobben sin. Hugs at restriksjonsenzyma klipper i bestemte mønster.
- Overfør genet som kodar for ønskt eigenskap, til plasmidet. Passar bitane saman? Bruk enzymet ligase til å lime bitane saman.
Genet som kodar for ønskt eigenskap, inneheld ein seleksjonsmarkør. Sjekk om genmodifiseringa blei vellykka, ved å identifisere seleksjonsmarkøren i genet du har sett inn i plasmidet. Bruk gjerne ein fargestift til å markere seleksjonsmarkøren.
Seleksjonsmarkør:
TGCAATT
- Gratulerer med vellykka framstilling av rekombinant DNA og bruk av illustrert genteknologi. For at proteinet det humane genet kodar for, skal kunne masseproduserast, må plasmidet setjast inn i ein bakterie som blir dyrka vidare under optimale forhold. Bruk kreativiteten din for å illustrere dette.
Filer
Denne sida er ei omarbeidd utgåve av Modellforsøk – rekombinant DNA frå Bioteknologirådet.