Agar brukes som substrat for dyrking av bakterier og sopp. Det er et polysakkarid som utvinnes fra alger, og som kan kjøpes i pulverform. Agar løser seg opp i kokende vann og stivner til gelé når temperaturen kommer ned mot 40 °C.

I denne øvingen skal vi lage klar agarskåler som skal brukes til å dyrke bakterier i. Vi bruker næringsagar, som er agar blandet med gjærekstrakt, vitaminer og andre organiske forbindelser.

• erlenmeyerkolbe 500 ml
• termometer (gjerne et IR ikke-kontakttermometer)
• bunsenbrenner
• sterile petriskåler av plast (90 eller 100 mm)
• nøyaktig vekt
• autoklav
• etanol eller isopropanol
• destillert vann
• næringsagar (for eksempel LB-agar)
• hansker

Vernetiltak: Unngå å puste inn av agarstøv i punkt 1. Beskytt deg mot varme flater og damp i punkt 2, bruk frakk, vernebriller og tykke hansker.

Aseptiske tiltak: I arbeidet med punkt 3 i del 1 og hele del 2, skal du bruke frakk, latex- eller nitrilhansker og jobbe i en sterilbenk eller i et desinfisert avtrekksskap uten at avtrekksvifta står på. Du kan også la en gassbrenner stå og brenne inne i skapet i del 2.

Del 1

1. Tilsett 10–15 g næringsagar til 250 ml destillert vann i en 500 ml erlenmeyerkolbe. (Dette er veiledende, sjekk oppskriften som står i bruksanvisningen for den næringsagaren du bruker.)
2. Roter kolben for å blande løsningen. Det er ikke nødvendig at alt løses opp, men pass på at det ikke er store klumper med agar. Unngå også at det fester seg mye agar på glassveggen over vannflaten.
3. Dekk toppen av kolben med aluminiumsfolie, og plasser i autoklav. Steriliser i minimum 15 minutter på 121 °C. Ta kolben ut av autoklaven når denne er avkjølt til under 80 °C.

Del 2

1. Mens du venter på at autoklaven avkjøles, skal du desinfisere benken du skal jobbe på. Tørk grundig over med etanol eller isopropanol. En sterilbenk som gir produktbeskyttelse, er ideell til formålet.
2. Sett kolben til avkjøling på den desinfiserte benken i avtrekksskapet. Drei flaska forsiktig av og til for å blande innholdet.
   Flammesteriliser termometeret (eller bruk et ikke-kontakttermometer), og mål temperaturen på agarløsningen.
   Når temperaturen er under 55 °C, kan du begynne å fylle i petriskålene. Gjør klar skåler mens du venter (se punkt 5).
3. Sett 6 sterile petriskåler etter hverandre på benken med lokket på. Merk bunnen med initialene dine, dato og type næringsagar. Skriv gjerne smått langs kanten, slik at teksten ikke skjermer for tolking av dyrkingsforsøket.
   Flammesteriliser tuten på erlenmeyerkolben mellom hver gang du fyller agar i en skål. Ta av lokket på petriskålen med en hånd og hold det i skråstilling over bunnen mens du fyller bunnen omtrent halvfull med den flytende agaren.
4. Legg lokket forsiktig på, men la det være en liten gløtt sånn at vanndamp luftes ut. La petriskålene stå i ro til agaren har stivnet. Legg på lokket helt etter 10–15 minutter, eller når agaren har fått samme temperatur som omgivelsene.
   Hvis du jobber i avtrekksskap, bør vifta være avslått for å hindre at forurenset luft (mikroorganismer) trekkes inn til agarplatene.

Lagring av skålene:
For å unngå at kondensvann fra lokket renner ned i agaren, oppbevares skålene med bunnen opp. Hvis du ikke skal bruke skålene med en gang, må de pakkes inn i plast og lagres i kjøleskap. Slik kan de holde seg i mange uker uten at de tørker ut. Bruk gjerne posen som de sterile petriskålene kom innpakket i (hvis den fortsatt er ren), og tett åpningen godt.

Når du jobber sterilt, er det viktig å være nøye med adferden din, valg av utstyr og prosedyrer, plassering av utstyr og håndtering av prøver. Det hjelper lite at nesten alt er sterilt, hvis det glipper i et ledd. Drøft følgende:

1. Hvilke mulige forurensingskilder finnes her?
2. Hvordan kan vi redusere faren for kontaminering?
3. Hva kan skje hvis prøvene blir forurenset?